De genomiska sekvenserna för de flesta virus har varit kända.Nukleinsyrasonder som är korta DNA-segment utformade för att hybridisera med komplementära virala DNA- eller RNA-segment.Polymeraskedjereaktionen (PCR) är en mer effektiv teknik för virusdetektion.Diagnostiska metoder med hög genomströmning har utvecklats nyligen.
A. Nukleinsyrahybridiseringsteknik
Nukleinsyrahybridisering, huvudsakligen inklusive Southern blotting(Southern) och Northern blotting(Northern), är en ny teknik under snabb utveckling inom det virusdiagnostiska området.Grunden för hybridiseringsanalysen är att använda korta segment av DNA (kallad "sond") utformade för att hybridisera med komplementära virala DNA- eller RNA-segment.Genom uppvärmning eller alkalisk behandling separeras dubbelsträngat mål-DNA eller RNA i enkelsträngar och immobiliseras sedan på ett fast underlag.Därefter tillsätts sond och hybridiseras med mål-DNA eller RNA.Eftersom sonden är märkt med isotop eller icke-radioaktiv nuklid, kan mål-DNA eller RNA detekteras genom autoradiografi eller av biotin-avidin-systemet.Eftersom de flesta virusgenom har klonats och sekvenserats kan de detekteras med virusspecifika sekvenser som prober i provet.För närvarande inkluderar hybridiseringsmetoderna: dot blot, in situ hybridisering i celler, DNA blotting (DNA) (Southern blöt) och RNA blotting (RNA) (Northern blöt).
B.PCR-teknik
Under de senaste åren har en serie nukleinsyraamplifieringstekniker in vitro utvecklats baserade på PCR, för att testa okänsliga eller oodlingsbara virus.PCR är en metod som kan syntetisera specifik DNA-sekvens genom in vitro polymerasreaktion.Processen för PCR inkluderar en termisk cykel av tre steg: denaturering, hybridisering och förlängning. Vid hög temperatur (93℃~95℃) separeras det dubbelsträngade DNA:t i två enkla DNA-strängar;sedan vid låg temperatur (37℃~60℃), hybridiserar två syntetiserade nukleotidprimrar till de komplementära DNA-segmenten;medan vid lämplig temperatur för Taq-enzym (72 ℃) börjar syntes av nya DNA-kedjor från primer 3'-änden med hjälp av komplementärt DNA som mallar och enstaka nukleotider som material.Så efter varje cykel kan en DNA-kedja amplifieras till två kedjor.Genom att upprepa denna process kan varje DNA-kedja som syntetiseras i en cykel användas som mall i nästa cykel, och antalet DNA-kedjor fördubblas i varje cykel, vilket innebär att produktionen av PCR amplifieras i en 2n log-hastighet.Efter 25 till 30 cykler identifieras produktionen av PCR genom elektrofores, och de specifika DNA-produkterna kan observeras under UV-ljus (254nm).För sin fördel av specificitet, känslighet och bekvämlighet har PCR använts vid klinisk diagnos av många virusinfektioner såsom HCV, HIV, CMV och HPV.Eftersom PCR är mycket känslig, kan den detektera virus-DNA på fg-nivå, bör operationen utföras mycket noggrant för att undvika falska positiva.Dessutom betyder positivt resultat i nukleinsyratest inte att det finns levande infektiöst virus i provet.
Med bred tillämpning av PCR-teknik utvecklas nya tekniker och metoder baserade på PCR-teknik för olika teständamål.Till exempel kan realtids kvantitativ PCR detektera viral belastning;in situ PCR används för att identifiera virusinfektion i vävnad eller celler;Den kapslade PCR kan öka specificiteten för PCR.Bland dem har kvantitativ PCR i realtid utvecklats snabbare.Många nya tekniker, såsom TaqMan-hydrolysprob, hybridiseringsprob och molekylär beacon-prob, har kombinerats till kvantitativ PCR-teknik i realtid, som används allmänt i klinisk forskning.Förutom att exakt identifiera virusmängden i patienternas kroppsvätska, kan denna metod också användas för att upptäcka läkemedelstolerant mutant.Därför används kvantitativ PCR i realtid främst vid utvärdering av kurativ effekt och övervakning av läkemedelstolerans.
C. High-throughput-detektion av virala nukleinsyror
För att möta behoven av snabb diagnos av nya framväxande infektionssjukdomar har olika högkapacitetsdetekteringsmetoder, som DNA-chips (DNA), etablerats.För DNA-chips syntetiseras specifika prober och fästs till små kiselchips i mycket hög densitet för att bilda DNA-sondsmikroarray (DNA) som kan hybridiseras med prov.Hybridiseringssignalen kan avbildas med konfokalmikroskop eller laserskanner och bearbetas vidare av datorn och en enorm datauppsättning om olika gener kan erhållas.Det finns två typer av DNA-chip."Synteschippet" är som följer: de specifika oligonukleotiderna syntetiseras direkt på chipsen.En annan är DNA pool chip.De klonade generna eller PCR-produkterna är ordnade tryckta på objektglaset.Fördelen med DNA-chipteknologi är den samtidiga upptäckten av en enorm mängd DNA-sekvenser.Den senaste versionen av patogendetektionschip kan identifiera över 1700 mänskliga virus samtidigt.DNA-chipteknologi löste problemen med traditionella nukleinsyrahybridiseringsmetoder och har mycket breda tillämpningar inom virusdiagnostik och epidemiologiska studier.
Posttid: 23 december 2020